相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢?它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎?原來,雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、***觀察!由于電磁波的波長(zhǎng)越短,粒子性越強(qiáng),受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光,在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外,因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),所以掃描的精確度極高,也能提高激發(fā)光效率,減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例;進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì):在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像,雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是,共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,通過單光子激發(fā)熒光,而雙光子使用飛秒激光器,通過幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì):雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng),所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,雙光子則能達(dá)到250到500微米,甚至超過1毫米。另外,同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織,并且生成更清晰的圖像。國內(nèi)雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被發(fā)動(dòng),所以雙光子成像更清晰。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,而1997年在Svoboda測(cè)量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動(dòng)態(tài)后,雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡,其成像視場(chǎng)達(dá)到5毫米,能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見:這種顯微鏡的視場(chǎng)是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來,雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計(jì)了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,發(fā)展速度可見一斑。
2008年錢永健等人由于熒光蛋白(GFP,綠色熒光蛋白)的發(fā)現(xiàn)和使用,獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),是對(duì)熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動(dòng)。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特點(diǎn),再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合,使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分,并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下(狀態(tài))對(duì)其功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的,生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前,大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是,大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵:只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測(cè)的信號(hào)會(huì)受到樣本組織的散射和吸收,根本無法穿透如此深的組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡(Two-photonMicroscopy,簡(jiǎn)稱TPM)的發(fā)明,則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性,再加上其工作波長(zhǎng)處在紅外區(qū)域等特點(diǎn),令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高,使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行神經(jīng)成像較理想的工具。這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍。

王愛民副教授結(jié)合工作實(shí)例,展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,重量只為2.2克,這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像,該顯微鏡適于佩戴在小動(dòng)物頭部,可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào),在大型動(dòng)物上,還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,在亞微米級(jí)成像,此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類顯微鏡性能類似;雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無創(chuàng)地,根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,區(qū)分成像;雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,在無造影劑的前提下,利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。進(jìn)口雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)
雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),還有一些短波長(zhǎng)可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)
后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7、8、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況,來驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)期觀察的適用性。在觀察期間,88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間,曝光間隔1s照射樣品,激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2,激發(fā)波長(zhǎng)為525nm,使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知,延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷,對(duì)于實(shí)際3D延時(shí)成像,由于焦平面是移動(dòng)的,所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會(huì)更長(zhǎng),可見這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很大優(yōu)勢(shì)的成像方案。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)
滔博生物,2019-05-27正式啟動(dòng),成立了nVista,nVoke,3D bioplotte,invivo等幾大市場(chǎng)布局,應(yīng)對(duì)行業(yè)變化,順應(yīng)市場(chǎng)趨勢(shì)發(fā)展,在創(chuàng)新中尋求突破,進(jìn)而提升Inscopix,envisionTEC,rokit,piezosleep,stoeltingco,unipick,neuronexus,scientifica,alphaomega,divescope,invivo的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,把握市場(chǎng)機(jī)遇,推動(dòng)儀器儀表產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步。是具有一定實(shí)力的儀器儀表企業(yè)之一,主要提供nVista,nVoke,3D bioplotte,invivo等領(lǐng)域內(nèi)的產(chǎn)品或服務(wù)。同時(shí),企業(yè)針對(duì)用戶,在nVista,nVoke,3D bioplotte,invivo等幾大領(lǐng)域,提供更多、更豐富的儀器儀表產(chǎn)品,進(jìn)一步為全國更多單位和企業(yè)提供更具針對(duì)性的儀器儀表服務(wù)。值得一提的是,滔博生物致力于為用戶帶去更為定向、專業(yè)的儀器儀表一體化解決方案,在有效降低用戶成本的同時(shí),更能憑借科學(xué)的技術(shù)讓用戶極大限度地挖掘Inscopix,envisionTEC,rokit,piezosleep,stoeltingco,unipick,neuronexus,scientifica,alphaomega,divescope,invivo的應(yīng)用潛能。
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