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王愛民副教授結(jié)合工作實(shí)例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動(dòng)物頭部，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)，在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級(jí)成像，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無(wú)創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無(wú)造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。進(jìn)口激光雙光子顯微鏡熒光探測(cè)雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被發(fā)動(dòng)，所以雙光子成像更清晰。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國(guó)家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國(guó)智造”隊(duì)伍。目前，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國(guó)家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動(dòng)的中國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃?？梢云诖?，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。激光雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

對(duì)于顯微成像技術(shù)包含：寬場(chǎng)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式

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