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研究人員通過(guò)用不同激光波長(zhǎng)并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，并同時(shí)保持較高的時(shí)間和空間分辨率。通過(guò)引入兩種波長(zhǎng)不同的鈣信號(hào)熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩個(gè)不同顏色，并同時(shí)用兩個(gè)不同波長(zhǎng)的激光激發(fā)探針，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個(gè)激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同時(shí)以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個(gè)平面，覆蓋縱深達(dá)600微米，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達(dá)到2000個(gè)以上。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點(diǎn)，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小。ultima雙光子顯微鏡廠家電話雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè)。

FHIRM-TPM 2.0擴(kuò)大了微型雙光子顯微鏡的適用性和實(shí)用性，使神經(jīng)科學(xué)家能夠更自由地探索更多新的行為范式，包括身體運(yùn)動(dòng)、長(zhǎng)時(shí)程的復(fù)雜過(guò)程，如學(xué)習(xí)和記憶，社會(huì)互動(dòng)和恐懼條件反射，甚至是慢性疾病的進(jìn)展和老化，如神經(jīng)發(fā)生和再生，疾病進(jìn)展和衰老，以破譯大腦的奧秘。在一批“早鳥(niǎo)項(xiàng)目”中，該系統(tǒng)已被多個(gè)研究組應(yīng)用于不同的模式動(dòng)物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識(shí)別、斑胸草雀受***調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項(xiàng)研究。依托兩代微型化雙光子成像技術(shù)，該團(tuán)隊(duì)還在南京市江北新區(qū)建立了規(guī)?；咄磕X功能成像的南京腦觀象臺(tái)（Nanjing Brian Observatory），于2020年12月10日舉辦了落成典禮。通過(guò)與世界范圍內(nèi)的神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行廣合作，腦觀象臺(tái)現(xiàn)正在服務(wù)三十多個(gè)科研項(xiàng)目，成為開(kāi)展大型腦科學(xué)問(wèn)題研究的重要科研服務(wù)平臺(tái)。

使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快。目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。成像平臺(tái)倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。國(guó)外ultima雙光子顯微鏡商家電話

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商

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