雙光子顯微成像技術不是什么新技術,早在20多年前就有了,目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子**過期后,已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此,世界上很多實驗室都搭雙光子,自己搭的好處有很多,首先是便宜,尤其是實驗室已經有飛秒激光器,那就更很省錢了。其次是靈活,可以選擇針對特殊用途的搭配,改動也靈活。結束后的好處就是可以鍛煉隊伍,一趟走下來可以把新手帶出來,后期維護也更加自由。當然壞處也不少,首先是操心,特別是第1次搭的時候,開始要想方案,后來要解決各種實際問題。其次是花時間,加上買配件的時間,比買一臺現成的商業(yè)化雙光子耗時長?,F在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章,各種protocol,大多是老外寫的,中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統還是不容易的,尤其是沒有經驗的時候,容易走彎路,多花錢,也多花時間,再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,在國內買這些東西耗時較長。因此,我想總結一下我們的經驗,貼出來分享,希望能幫到想自己動手的實驗室雙光子顯微鏡中,同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測,并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國ultima雙光子顯微鏡價格

對生物樣品的三維觀測是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術包括光片顯微成像技術、晶格光照明技術以及激光掃描顯微成像技術(如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡)等。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉盤可以進行多焦點的激光掃描,提高時間分辨率,而且有利于減少活細胞成像中的光損傷。本篇文獻主要實現了可見光雙光子激發(fā)及多焦點激光掃描的結合,終提高了3D延時掃描中的空間分辨率及成像對比度,同時這也是可見光雙光子激發(fā)(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡的原理在深度組織中以較長時間對細胞成像,雙光子顯微鏡是當前之選。

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,在我們的實驗中,時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點掃描系統中,v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,這主要是多聚焦成像和單點掃描技術之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,引入圖像掃描技術可以進一步提高空間分辨率,這種技術需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現。除此之外,由于可見光區(qū)域的共振效應,可能會產生光漂白,因而為了延長觀察時間,系統還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化。
高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞,所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,而其頻率可以達到80至100兆赫,這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,又能不損傷細胞,使掃描能更好地進行。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例生物領域:貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經元細胞內鈣離子動力學情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領域:美國科學家Rentzepis提出了一種在現有二維光盤的基礎上將數據儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點,避免了層與層之間的互相干擾,極大地提高了數據儲存密度。雙光子顯微鏡非常適合對細胞組織進行長時間在體成像。

美國霍華德·休斯醫(yī)學研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應光學的方法和雙光子顯微鏡結合,研制出一種新的自適應光學雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差,在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數倍的成像分辨率和信號強度,明顯改進了成像質量,使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見,她們成功將該方法應用于老鼠視覺皮層第五層(約500μm)的形貌結構成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應光學方法,使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現實。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。布魯克雙光子顯微鏡光子躍遷
優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應。美國ultima雙光子顯微鏡價格
2020年12月22日,臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,北京大學信息科學技術學院副教授,畢業(yè)于北京大學物理系,獲學士、碩士學位,后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”,并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用,為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。美國ultima雙光子顯微鏡價格
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